选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家汉斯·克里斯蒂安·约阿希姆·革兰氏（HansChristianJoachimGram，1853-1938）创立。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。
注意事项:
1.选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
2.涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
3.脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性。
方法原理：
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
如何保证革兰氏染色的可靠性
作对照试验，找已知菌群对照。
找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别做混合涂片，当和G+做时G+正确显紫色和当和G-做时G-正确显红色，看这个未知菌分别显什么色，若一致，则可确定此菌为G+或G-。
再回过头单做此未知菌的革兰氏染色，显现正确那就证明此染色技术操作正确。也可在开始做已知的与此菌形态明显不同的G+和G-三者混合涂片，一下知晓此未知菌的阴阳性，再回过头来染色。
革兰氏染色的注意事项：
1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3、选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
4、脱色时间不要过长。
以上内容参考 百度百科-革兰氏染色
革兰氏染色需要注意哪些问题 为什么
1.选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
2.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3.脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
革兰染色的实验目的？
本次实验是通过一种特殊的染色方法-----革兰氏染色法进行细菌鉴定。细菌一般可分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，本实验将通过革兰氏染色使细菌呈现不同的颜色以达到鉴别菌种的目的。 革兰氏阴性菌将呈现红色，革兰氏阳性菌将呈现紫红色。要想达到此目的，要求革兰氏染色必须成功。因此，在实验中要特别注意革兰氏染色的注意事项和影响实验成功的关键因素。除了掌握革兰氏染色法外，我还掌握了油镜的使用。实验得到了应有的结果，通过其颜色不同鉴别了实验菌种的革兰氏阴阳性。
